一般使用辣根過氧化物酶 HRP-ECL 發光法或堿性磷酸酶 AP-NBT/BICP 顯色法。

1．HRP-ECL 發光法：

將 A、B 發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈**可見淡綠色熒光條帶（5 min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2 min，清水漂洗一下后放在定影液中**底片完全定影，清水沖凈晾干，標定 Marker，進行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP 顯色法：

每片 NBT/BICP 可溶解于 30 ml 水中，使用前將一片分裝在 30 個 EP 管中，每張 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。將 PBST 或 TTBS 洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色 20 s 后每 10 s 觀察一次，**條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

注：背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關，當然如果暴光時間長達半小時，出現背景是正常的。