電泳分離技術(shù)

電泳是帶電粒子在電場(chǎng)作用下的遷移。帶正電的粒子向陰極遷移，帶負(fù)電的粒子向陽極遷移。它們的遷移速率取決于電場(chǎng)強(qiáng)度，粒子（即分子）的凈電荷，大小和形狀以及分子在其中移動(dòng)的介質(zhì)的離子強(qiáng)度，粘度和溫度。作為一種分析工具，電泳簡(jiǎn)單，快速且靈敏度高。由于許多重要的生物分子（例如核酸和蛋白質(zhì)）都具有可電離的基團(tuán)，因此它們?cè)谌魏谓o定的pH值下都帶有電荷。因此，電泳是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中最廣泛使用的技術(shù)之一。

核酸由于其磷酸鹽主鏈而帶負(fù)電荷，因此會(huì)向陽極遷移。通過電泳分離核酸在支持基質(zhì)或“凝膠”中進(jìn)行，最常用的是瓊脂糖或聚丙烯酰胺。通常，將凝膠澆鑄成薄板狀，并帶有用于裝載樣品的孔。將凝膠浸入電泳緩沖液中，電泳緩沖液提供離子以承載電流，并提供某種類型的緩沖液以將pH維持在相對(duì)恒定的值。載體基質(zhì)提供了按大小分離分子的方法，因?yàn)樗鼈兪嵌嗫啄z。多孔凝膠可以通過阻止或在某些情況下完全阻止大分子的移動(dòng)，同時(shí)允許較小的分子自由遷移來充當(dāng)篩子。

瓊脂糖是從海藻中提取的多糖。通常以0.5％至2％的濃度使用。瓊脂糖濃度越高，凝膠“就越硬”。瓊脂糖凝膠具有較大的分離范圍，但分離能力較低。通過改變瓊脂糖的濃度，可以使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)分離約200至50,000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物。聚合物鏈的長(zhǎng)度取決于所用丙烯酰胺的濃度，通常在3.5％至20％之間。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍很小，但分離能力非常高。對(duì)于DNA，聚丙烯酰胺用于分離小于約500 bp的片段。但是，在適當(dāng)?shù)臈l件下，單個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度不同的DNA片段很容易分辨。與瓊脂糖相反，聚丙烯酰胺凝膠被廣泛用于分離和表征蛋白質(zhì)混合物。

對(duì)于大多數(shù)DNA和RNA樣品，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離。由于磷酸鹽骨架，由于DNA或RNA的任何給定片段中每單位長(zhǎng)度的電荷相同，因此所有樣品在施加電場(chǎng)的情況下都以相同的遷移率移向陽極。發(fā)生在瓊脂糖基質(zhì)中的分離是因?yàn)樗梢宰柚购怂岬囊苿?dòng)。最大的分子穿過凝膠孔的困難最大，而最小的分子移動(dòng)沒有太大困難。這樣，凝膠電泳期間核酸的遷移率將取決于大小，最小的分子移動(dòng)最快。

凝膠電泳后，需要對(duì)凝膠中的核酸進(jìn)行染色和可視化。最常用的染色劑是熒光染料溴化乙錠。該分子插入核酸分子，可以在紫外線下觀察。凝膠顯示對(duì)應(yīng)于具有不同分子量的不同核酸分子群體的條帶。片段大小通常以“核苷酸”，“堿基對(duì)”或“ kb”（對(duì)于數(shù)千個(gè)堿基對(duì)）報(bào)告，具體取決于單鏈或雙鏈DNA是否已分離。通常通過與包含已知長(zhǎng)度的線性DNA片段的市售DNA階梯進(jìn)行比較來確定片段大小。

到目前為止，已經(jīng)討論過的通過電泳分離的核酸處于天然狀態(tài)。在這種情況下的電泳條件稱為非變性。當(dāng)要確定DNA序列或要確定RNA大小時(shí)，使用變性條件。DNA測(cè)序凝膠在變性劑（例如尿素和甲酰胺）的存在下運(yùn)行，并且由于所分析的DNA分子較短，因此使用丙烯酰胺凝膠代替瓊脂糖。通過凝膠電泳確定RNA的大小需要用變性劑例如甲醛，乙二醛和甲基汞氫氧化物使RNA變性。

為了鑒定凝膠中特定核苷酸序列的存在，使用了一種稱為Southern印跡（如果正在分析DNA）或Northern印跡（正在分析RNA）的技術(shù)。在這兩種情況下，來自完整凝膠的DNA或RNA都將轉(zhuǎn)移到一塊硝酸纖維素膜或尼龍膜上。然后將膜暴露于雜交探針，即具有特定序列的單個(gè)DNA片段，要確定其在靶DNA（或RNA）中的存在。對(duì)探針DNA進(jìn)行標(biāo)記，以便通常可以通過引入放射性或用熒光或發(fā)色染料標(biāo)記分子來對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

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